O fluorímetro de clorofila FMS 2+ consiste em uma unidade de controle que abriga toda a eletrônica, óptica e fontes de luz necessárias para derivar os parâmetros mais comuns de fluorescência da clorofila. Esses cabos são ligados opticamente à amostra por um cabo de fibra óptica estatisticamente randomizado que está posicionado no clipe de folhas FMS/PTL PAR/temperatura. O cabo de fibra óptica também é adequado para inserção em uma variedade de recipientes de amostras, como câmaras de eletrodos de oxigênio, câmaras antigas de análise de gases, placas de Petri e placas de microtítulo.

O sistema pode ser operado em vários modos diferentes: a conexão serial a um PC com Windows® permite controle em tempo real de instrumentos e apresentação de dados. Os dados capturados são apresentados simultaneamente como uma emulação em tempo real de um gravador de gráficos e formato apenas de parâmetros para fácil identificação de eventos experimentais chave. Esse modo de operação PC é adequado para o desenvolvimento de protocolos complexos que podem ser programados no instrumento usando o editor simples de arrastar e soltar para gerar scripts definidos pelo usuário. Esses scripts automatizam a execução de experimentos em campo, permitindo que protocolos complexos envolvendo muitos eventos de controle sejam operados com a mesma facilidade da medição de eventos de controle único, como . Uma vez programado, o FMS 2+ pode ser usado como um fluorímetro de clorofila independente em situações de laboratório ou de campo, operando a partir de baterias internas com todos os dados de medição e parâmetros calculados salvos em memória protegida integral. A unidade pode armazenar até seis protocolos experimentais, qualquer um dos quais pode ser acessado e executado usando o sistema de menus embutido. Quando a coleta de dados estiver concluída, os resultados podem ser baixados para o software Windows® para análise completa.

Todas as fontes de luz necessárias para a medição modulada dos parâmetros comuns de fluorescência da clorofila são auto-contidas dentro do instrumento.

FMS/PTL Leafclip

O PAR/clipe de temperatura está disponível para facilitar medições feitas sob condições de luz ambiente usando o fluorímetro de clorofila FMS 2+. Medições de fluorescência com clorofila podem ser feitas de forma bastante satisfatória sem o clipe de folhas, mas um valor de PAR do sensor de luz no clipe é essencial para a estimativa da taxa de transporte de elétrons () pelo software FMS. Outros parâmetros de fluorescência da clorofila não são afetados se o sistema for operado sem o clipe de folhas.

O clipe de folhas FMS/PTL consiste em uma seção superior com mola que segura suavemente a amostra em uma ação de fixação suave. Um pescoço ranhurado montado a 60° em relação ao plano da amostra acomoda o cabo de fibra óptica, que é deslizado para a posição.

Graduações marcadas no pescoço podem ser alinhadas com graduações na terminação do cabo de fibra óptica para referenciar sua posição em trabalhos futuros; um parafuso de retenção a trava na posição durante todo o experimento. O restante do cabo de fibra óptica pode ser enrolado sobre o clipe de folhas e preso à parte traseira do clipe para ajudar a suportar seu peso. Um sensor PAR totalmente correto por cosseno e um termopar de 0°C a 90°C também são instalados no FMS/PTL.

Uma conexão elétrica ao soquete do clipe de folha no painel frontal do fluirômetro de clorofila FMS 2+ permite o uso do interruptor de gatilho remoto para ativar/abortar medições em modo local e conectar o termopar do clipe de folhas e o sensor de luz à unidade de controle. O clipe de folhas pode ser segurado na mão se várias amostras estiverem sendo estudadas ou montado em um tripé padrão por meio de uma rosca na seção inferior do clipe para trabalho em posição fixa.

O sensor PAR foi projetado tanto para registrar as intensidades da luz ambiente durante a análise de fluorescência quanto para a medição de fontes de luz actínica e saturada do FMS durante a configuração do instrumento.

Sistema de Bateria Intercambiável em Campo

O fluorímetro de clorofila FMS 2+ é alimentado por uma bateria de chumbo-ácido de 2,0 ahr, capaz de medir >8 horas contínuas em campo. As baterias podem ser facilmente trocadas no campo à medida que são descarregadas.

2 baterias são fornecidas com o FMS 2+ que, quando ambos totalmente carregados, proporcionam facilmente pelo menos 2 dias completos de medição em campo. A bolsa de transporte FMS 2+ tem espaço na parte inferior para carregar a bateria sobressalente.

Modfluor32 & Parview32 Software

O controle para PC a partir do software Modfluor32 para Windows® permite traçar traços em tempo real como uma emulação de gravador de gráficos, com parâmetros calculados escritos em uma janela de parâmetros de texto. Recursos do instrumento e rotinas de medição de parâmetros são selecionados a partir de uma barra de ferramentas com menus suspensos para controlar o manuseio de arquivos e a configuração do instrumento.

Protocolos experimentais complexos podem ser automatizados para reduzir trabalhos repetitivos desenvolvendo scripts usando um editor de script iconizado, que permite que uma sequência de funções de controle e medições seja desenvolvida em um protocolo. Uma vez criados, scripts podem ser executados diretamente do programa Modfluor32 e os dados visualizados enquanto o instrumento completa automaticamente um experimento definido pelo usuário. No máximo, seis scripts podem ser baixados para a memória interna do instrumento para operação sem computador.

A conexão de uma bateria externa opcional ao FMS 1+ (o FMS 2+ é fornecido com baterias) permite operação portátil com dados armazenados na memória do instrumento para upload subsequente e apresentação gráfica completa no computador.

Uma aplicação adicional também está incluída com os fluorímetros de clorofila FMS 1 e FMS 2+. Parview32 é uma ferramenta independente projetada para permitir o upload e a transferência fácil de múltiplos arquivos de parâmetros para um programa do tipo planilha.

Parâmetros do FMS Medidos

Parâmetros adaptados ao escuro medidos

A adaptação à escuridão inibe todas as reações dependentes da luz. A ausência resultante de fotoquímica por um período suficiente permite a reoxidação completa das moléculas aceitadoras de elétrons PSII, abrindo centros de reação PSII e, assim, maximizando a probabilidade de que a luz absorvida possa ser usada para fotoquímica. Parâmetros comumente medidos a partir de tecidos nesse estado são usados para calcular a eficiência quântica máxima da PSII e geralmente são usados para referenciar medições feitas em amostras adaptadas à luz.

 – A origem de fluorescência () é definida como o rendimento de fluorescência da clorofila após a adaptação à escuridão quando todos os centros de reação PSII e moléculas aceitadoras de elétrons estão totalmente oxidados e, portanto, disponíveis para fotoquímica. Como resultado,  é frequentemente medido no início de um experimento, quando apenas o feixe modulador está iluminado.

 – O rendimento máximo de fluorescência () é alcançado quando a amostra adaptada à escuridão é exposta a um intenso pulso saturado de luz proveniente do fluorômetro de clorofila. Isso reduz temporariamente todos os aceitadores de elétrons PSII, impedindo a fotoquímica PSII. A ausência temporária de competição da fotoquímica pela energia absorvida garante máxima emissão de fluorescência de clorofila da amostra.

 – A diferença entre o  rendimento da fluorescência e  da clorofila relaciona a capacidade máxima para extinção fotoquímica da energia pela amostra e é definida como fluorescência variável ().

 – O cálculo das constantes de taxa para vias concorrentes de dissipação de energia em tecidos sob condições adaptadas ao escuro () e saturadas de luz () mostraram que a razão entre fluorescência variável e máxima da clorofila () é diretamente proporcional à eficiência quântica da fotoquímica PSII (Butler 1977, 1978^1). A estreita correlação com outras medidas de eficiência quântica da fotoquímica em uma ampla gama de espécies (Björkman e Demmig 1987²) resultou no uso generalizado de  como parâmetro de triagem para resposta ao estresse.

Parâmetros adaptados à luz

No caso de tecido adaptado à luz, uma proporção dos aceitadores de elétrons PSII é reduzida, fechando alguns centros de reação PSII. Portanto, a probabilidade de que a energia absorvida seja usada para fotoquímica não é máxima, pois processos não fotoquímicos concorrentes estão em operação. A medição da razão adaptada à luz da razão de fluorescência variável para a máxima da clorofila permite a estimativa da eficiência quântica PS II () usando o modelo de Genty et al. 1989^3.

,  e  – Várias medições do rendimento de fluorescência da amostra em diferentes estados definidos são necessárias para estimar . Inicialmente, é necessário o rendimento de fluorescência da amostra sob o regime de luz ambiente. Tais medições geralmente são feitas depois que uma amostra se adapta a um determinado regime de luz ou ambiente e está operando em estado estacionário. Consequentemente, a medição é frequentemente chamada de rendimento de fluorescência em estado estacionário ou .

Um pulso totalmente saturante do fluorímetro de clorofila é então necessário para fechar todos os centros de reação PSII; a inibição temporária da fotoquímica PSII garante que o rendimento máximo de fluorescência () seja alcançado. Se uma medição adaptada ao escuro anterior de  foi realizada, a extensão dos processos de têmpera fotoquímica e não fotoquímica pode ser determinada a partir das equações de Schreiber et al. 1986^4.

 e  – A adaptação a alta irradiância pode envolver mudanças significativas na confirmação do aparelho fotossintético que resultam em dissipação de energia não fotoquímica nas antenas PSII, antes que a energia alcance os centros de reação (Horton et al. 1991⁵, Horton e Ruban 1994⁶). A falha em considerar esse efeito pode levar a imprecisões no cálculo das contribuições relativas da dissipação de energia fotoquímica e não fotoquímica. Esse problema pode ser superado sombreando transitoriamente a amostra e usando uma fonte de luz vermelha distante para excitar preferencialmente o PSI em relação ao PSII (os elétrons são puxados pela cadeia de transporte de elétrons, abrindo efetivamente os centros de reação do PSII e permitindo a medição de uma luz adaptada , geralmente dada a notação .

Outros parâmetros medidos

 – Registra o valor atual de radiação fotossinteticamente ativa incidente em μmol ^m-2 s-1 a partir do sensor PAR embarcado do FMS/PTL se conectado ao fluorômetro de clorofila. Por favor, note que o clipe de folhas FMS/PTL é fornecido de série com o FMS 2, mas deve ser adquirido como opção para o FMS 1.

 – Registra a temperatura atual em °C do termopar embarcado do FMS/PTL se conectado ao fluorômetro de clorofila. Por favor, note que o clipe de folhas FMS/PTL é fornecido de série com o FMS 2, mas deve ser adquirido como opção para o FMS 1.

 – Uma medida do coeficiente de têmpera fotoquímica calculada como:

 – Uma medida do coeficiente de têmpera não fotoquímica calculada como:

 – Uma definição alternativa de têmpera não fotoquímica calculada como:

 – Uma medida da taxa de transporte de elétrons calculada como:

A medição de  requer o clipe de folhas FMS/PTL, que é fornecido de série com o FMS 2+, mas deve ser adquirido como opção para o FMS 1+.

¹ Butler, W. L., (1977).
Fluorescência da clorofila: uma sonda para transferência de elétrons e transferência de energia.
Na Enciclopédia de Fisiologia Vegetal, ed. A. Trebst, M. Avron, 5, 149-167. Berlim: Springer-Verlag.

Butler, W. L., (1978).
Distribuição de energia no aparelho fotoquímico da fotossíntese.
Revisão Anual da Fisiologia Vegetal, 29, 345-378.

² Björkman, O. e B. Demmig (1987).
Produção de fótons da evolução do_O2 e características de fluorescência da clorofila em 77K entre plantas vasculares de diversas origens.
Planta, 170, 489-504.

³ Genty, B., Briantais, J-M. e N.R. Baker (1989).
A relação entre o rendimento quântico do transporte fotossintético de elétrons e a extinção da fluorescência da clorofila.
Biochimica et Biophysica Acta, 990, 87-92.

⁴ Schreiber, U., Schliwa, W. e U. Bilger (1986).
Registro contínuo de têmpera de fluorescência de clorofila fotoquímica e não fotoquímica com um novo tipo de fluorímetro de modulação.
Pesquisa em Fotossíntese, 10, 51-62.

⁵ Horton, P., Ruban, A.V., Rees, D., Pascal, A. A., Noctor, G. e A. J. Young (1991).
Controle da função de captação de luz das membranas cloroplastas por agregação dos complexos de proteína clorofila do LHCII.
FEBS Lett., 292,1-4.

⁶ Horton, P. e A. Ruban (1994).
O papel do complexo de captação de luz II na têmpera de energia. Em Fotoinibição da fotossíntese a partir de mecanismos moleculares para o campo
ed. N. R. Baker e J. R. Bowyer, pp. 111-128. Oxford: BIOS, Scientific Publishers Ltd.

Componentes do Sistema: