Analisador Multifuncional de Eficiência de Plantas e Fluorescência – M-PEA
M-PEA
Analisador de Eficiência Multifuncional
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Sistema avançado baseado em laboratório para investigação da eficiência fotossintética de plantas
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Variante M-PEA-1 para medições de fluorescência rápida e absorção modulada P700+
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Variante M-PEA-2 como M-PEA-1 com medições adicionais de fluorescência retardada (DF) e absorção foliar
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Unidade sensor sofisticada com todos os emissores ópticos e detectores em uma carcaça robusta e fechada
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Conexão USB com um PC com Windows®
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Software abrangente de design experimental, transferência de dados e análise de dados® para Windows
O M-PEA (Multi-Function Plant Efficiency Analyser) combina estudos cinéticos de fluorescência rápida de alta qualidade e absorção P700+ com medições inovadoras de fluorescência retardada (DF), fornecendo um dos sistemas mais abrangentes disponíveis para a investigação da eficiência fotossintética de plantas.
O M-PEA é um sistema de medição baseado em laboratório, composto por uma unidade de controle e uma unidade sensor sofisticada e robusta, que abriga todos os emissores ópticos e detectores para todos os elementos de medição.
O sistema é controlado a partir de um pacote de software Windows® abrangente (M-PEA) que permite que experimentos complexos sejam projetados, carregados e executados pelo hardware M-PEA. Os dados gravados são rapidamente baixados para o software via conexão USB 2.0.
A unidade de controle tem tamanho conveniente e área mínima de construção, permitindo que as medições sejam feitas em um ambiente de laboratório movimentado, onde o espaço da bancada é crítico. O painel frontal consiste em um interruptor de energia e LED indicador, conexão com sensor óptico e um display LCD de 4 linhas. O painel traseiro fornece entrada para uma fonte de alimentação de 12V DC e uma tomada USB 2.0 para interface com o software M-PEA rodando em um PC com Windows®.
Sensor Óptico M-PEA
A unidade sensor óptica é um gabinete robusto projetado para incorporar eletrônica sofisticada que controla efetivamente todas as fontes de luz e detectores. A unidade sensor M-PEA-1 inclui uma fonte actínica vermelha de alta intensidade, uma fonte de luz vermelha distante, o detector de fluorescência rápida e o par modulado emissor/detector para medições de absorvância P700+. O M-PEA-2 inclui adicionalmente um detector de fluorescência retardada de alta sensibilidade e um detector para medir a absorção das folhas.
Todas as ópticas estão localizadas atrás de uma janela de quartzo que sela a unidade sensora, proporcionando proteção eficaz para os conjuntos ópticos contra poeira, sujeira e umidade.
Absorção P700
A cadeia de transporte fotossintético de elétrons consiste em 3 grandes complexos proteicos: Fotosistema II (PSII), Citocromo (cyt b6/f), Fotosistema I (PSI). P700 é o termo usado para descrever a clorofila dentro do centro de reação do PSI, pois esse é o comprimento de onda da luz ao qual o fotosistema é mais reativo. Ao ser iluminado com uma fonte de luz forte, a cadeia de transporte fotossintético de elétrons é quase totalmente reduzida.
Os elétrons dessa redução, por sua vez, ativam a enzima ferredoxina-NADP+ redutase, o que leva eventualmente à redução do NADP e à fixação doCO2. Esse processo inicial de redução é representado pelos passos OJIP da curva de indução de Kautsky durante medições de fluorescência rápidas.
A oxidação do P700 causa um aumento na absorção em comprimentos de onda que caem na faixa de 800nm – 850nm. O M-PEA mede a transmissão do P700 usando um LED modulado com comprimento de onda pico de 820nm e um fotodiodo altamente sensível para monitorar a absorção do complexo PSI durante medições rápidas de fluorescência.
Como o LED de 820nm não é actínico, o M-PEA consegue usar altas intensidades de luz sem perturbar o complexo PSII. Portanto, o M-PEA apresenta um método conveniente e confiável para medir a fluorescência da clorofila e a transmissão a 820nm simultaneamente, permitindo assim o estudo do processo de transporte de elétrons durante a indução de Kautsky em ambas as extremidades do sistema fotossintético de transporte de elétrons.
O M-PEA também é equipado com uma fonte de luz vermelha distante que pode ser usada para excitar preferencialmente o complexo PSI. A reredução ocorre por meio da cadeia de transporte de elétrons interssistemas por atividade PSII, com elétrons originados pela hidrólise.
O M-PEA utiliza um LED de 820nm filtrado e modulado opticamente para medições de absorção P700 de alta qualidade. A atividade do P700 é registrada usando um fotodiodo PIN otimizado de baixo ruído e resposta rápida e conversor A/D de 16 bits, proporcionando uma excelente relação sinal-ruído.
Fluorescência Retardada
A fluorescência retardada (DF) tem muito em comum com a fluorescência imediata (PF) porque se origina das mesmas moléculas de clorofila dos complexos de antenas do Fotosistema II.
DF é essencialmente luz que é emitida por plantas verdes, algas e bactérias fotossintéticas por um curto período após terem sido expostas à luz, mas depois que a emissão de fluorescência rápida decai. A fluorescência retardada ocorre na região vermelho/infravermelha do espectro (igual à fluorescência imediata da clorofila). No entanto, a intensidade da emissão retardada de fluorescência é menor que a da fluorescência rápida em pelo menos duas ordens de grandeza, exigindo assim um aparelho altamente sensível para medir o sinal.
Assim como a PF, as propriedades da emissão de DF são altamente sensíveis ao estado funcional do Fotosistema II e à cadeia de reação fotossintética como um todo. Teoricamente, DF contém ainda mais informações sobre os processos fotossintéticos do que PF. Ainda assim, um instrumento de medição de fluorescência pode ser encontrado em quase todos os laboratórios de pesquisa em ciência das plantas, enquanto o DF não ganhou muita popularidade como método prático para estudar organismos fotossintéticos. Uma razão para essa injustiça é que o DF é mais difícil de registrar do que o PF. Mas a maior dificuldade ao usar DF é sua interpretação, ou extração das informações valiosas desse sinal extremamente complexo.
Felizmente, nos últimos anos testemunhamos grandes avanços tanto no desenvolvimento da engenharia eletrônica quanto na teoria das medições de DF. Estamos cada vez mais capazes de utilizar o DF para pesquisas científicas práticas. É a combinação desses dois fatores que levou ao desenvolvimento do M-PEA.
A emissão retardada de fluorescência, natural de todas as plantas verdes, é conhecida pelos cientistas há mais de cinquenta anos. Foi descoberta pela primeira vez por Strehler e Arnold (1951) quando tentavam usar a luminescência de vaga-lume para medir o acúmulo de ATP induzido pela luz na alga verde Chlorella. Eles descobriram que, mesmo sem a adição de luciferase e luciferina, havia um brilho duradouro de células de algas e cloroplastos na escuridão após a iluminação. A fluorescência retardada observada foi característica de diferentes amostras de fotossíntese usadas — folhas (Strehler e Arnold 1951), cloroplastos e bactérias fotossíntese (Arnold e Thompson 1956). Strehler e Arnold postularam que se tratava, na verdade, da quimioluminescência da clorofila, causada pela reversão das reações fotossintéticas. A relação próxima entre DF e as reações fotossintéticas foi confirmada sem dúvida em muitos estudos e, às vezes, DF foi considerada ainda mais sensível do que a fluorescência rápida (Kramer e Crofts, 1996).
Sistemas de fluorescência por excitação contínua como Pocket PEA, Handy PEA+ e M-PEA dependem do uso de um sistema de clipes de folhas adequado com 2 funções. Primeiramente, o clipe de folhas protege o detector de fluorescência da luz ambiente, que de outra forma “cegaria” o sensor devido aos níveis comparativamente altos de luz vermelha/infravermelha dentro da mesma faixa de onda da própria fluorescência. Em segundo lugar, o pré-condicionamento ou escuro-corte adapta uma seção da amostra antes da medição.
Qualquer medição da máxima eficiência fotoquímica do Fotosistema II (
) requer que a amostra seja totalmente adaptada à escuridão antes da medição. Durante a adaptação à escuridão, todos os centros de reação dentro da amostra são totalmente oxidados, tornando-os disponíveis para fotoquímica, e qualquer rendimento latente de fluorescência da clorofila é extinto. Esse processo leva um tempo variável e depende da espécie da planta, do histórico de luz anterior à transição escura e se a planta está sob estresse ou não. Normalmente, podem ser necessários de 15 a 20 minutos para se adaptar efetivamente à escuridão.
Clipes de folhas de adaptação escura são feitos de plástico, tornando-os pequenos e leves. O anel de localização (que se conecta ao sensor de fluorímetro) está posicionado sobre a área necessária da amostra e possui um orifício central de 4mm de diâmetro que é coberto por uma placa de obturador. Durante a medição, esse obturador desliza para trás para expor a amostra adaptada à escuridão aos LEDs focados e ao detector de fluorescência. Os clipes de folhas de PEA de bolso possuem um anel de localização preto, enquanto os clipes de folhas Handy PEA+ e M-PEA possuem um anel de localização branco com a parte inferior prateada, que reflete a luz incidente e minimiza o acúmulo de calor na amostra. Isso garante que a medição não seja afetada em condições de alta luz ambiente.
M-PEA+ Software
M-PEA+ é um pacote de software personalizado para Windows® criado para design experimental e implantação, além da análise abrangente de dados gravados. O M-PEA+ consiste em 2 elementos principais:
Editor de Protocolo M-PEA
O editor de protocolos permite a criação de experimentos para implantação no sistema M-PEA. Os experimentos podem variar em complexidade desde uma simples medição de fluorescência prompt de 1 segundo até medições repetitivas com múltiplos flashes usando fluorescência rápida e retardada, P700+ e absorção relativa para sondar a atividade dos complexos PSI e PSII dentro do aparelho fotossintético.
Módulos de Análise de Dados
Várias técnicas diferentes de apresentação de dados foram combinadas para demonstrar efetivamente diferenças sutis na assinatura de fluorescência das amostras. Os dados podem ser apresentados em gráficos gráficos, tabulados ou radiais, que podem ser ajustados para exibir qualquer número dos 58 parâmetros de fluorescência de prompt medidos pelo M-PEA. Os dados transferidos podem ser exportados para formato CSV para análise estatística adicional em pacotes de software externos.
O M-PEA+ rodará em todos os sistemas operacionais suportados pela Microsoft®.
Parâmetros comuns de fluorescência contínua de excitação medidos
– Representa a emissão por moléculas excitadas de clorofila A na estrutura das antenas do Fotosistema II. O nível verdadeiro só é observado quando o primeiro aceitador estável de elétrons do Fotosistema II chamado 
está totalmente oxidado. Isso exige uma adaptação completa às sombras.
– O valor máximo de fluorescência obtido para uma intensidade contínua de luz. Esse parâmetro só pode ser considerado máximo se a intensidade da luz usada for totalmente saturada e o aceitador de elétrons estiver totalmente reduzido.
– Indica o componente variável da gravação e relaciona-se à capacidade máxima para têmpera fotoquímica. Calculado subtraindo o valor do valor (
).
– Uma indicação da máxima eficiência quântica do Fotosistema II e amplamente considerada um indicador sensível do desempenho fotossintético das plantas. Apresentadas como uma proporção entre 0 e 1, amostras saudáveis normalmente atingem um valor máximo de aproximadamente 0,85. Valores inferiores a isso serão observados se uma amostra tiver sido exposta a algum tipo de fator de estresse biótico ou abiótico que tenha reduzido a capacidade de têmpera fotoquímica dentro do PSII. é apresentado como uma razão de fluorescência variável () sobre o valor máximo de fluorescência () e é calculado como 
.
– Indica o momento em que o valor máximo de fluorescência () foi atingido. Pode ser usado para indicar o estresse amostral que faz com que o alcance muito antes do esperado.
– A área acima da curva de fluorescência entre e é proporcional ao tamanho do pool dos aceitadores de elétrons no lado redutor do Fotosistema II. Se a transferência de elétrons dos centros de reação para o pool de quinona for bloqueada (como é o modo de ação do herbicida fotossinteticamente ativo DCMU), a área será drasticamente reduzida.
O tempo marca parâmetros
Os pacotes de software PEA Plus e M-PEA Plus extraem valores de fluorescência de clorofila a partir dos dados registrados dos fluorímetros de clorofila Handy PEA+, Pocket PEA e M-PEA em 5 Marcos de Tempo pré-definidos. Os horários são:
= 50 microssegundos
= 100 microssegundos
= (
passo) 300 microssegundos
= (
passo) 2 milissegundos
= (
passo) 30 milissegundos
Valores de fluorescência de clorofila nesses Marcos Temporais são usados para derivar uma série de parâmetros biofísicos adicionais, todos referidos à base temporal 0 (início da indução de fluorescência), que quantificam o comportamento do fotosistema II para (A) Os fluxos de energia específicos (por centro de reação) para:
- Absorção (
)
- Armadilhas (
)
- Dissipação (
)
- Transporte de elétrons (
)
e (B) as razões de fluxo ou resultam:
- Rendimento máximo da fotoquímica primária (
)
- Eficiência (
) com a qual um exciton aprisionado pode mover um elétron para dentro da cadeia de transporte eletrónica mais longe do que 
- Rendimento quântico do transporte de elétrons (
)
A concentração dos centros ativos de reação PSII por seção eficaz excitada (
) também é calculada.
Parâmetros do Índice de Desempenho (Análise OJIP)
O Índice de Desempenho (
) é essencialmente um indicador da vitalidade da amostra. É uma expressão geral que indica uma espécie de força interna da amostra para resistir a restrições externas. É uma Força da mesma forma que o potencial redox em uma mistura de pares redox é uma força. Exatamente, é uma força se usada em escala logarítmica. Portanto, dizemos:
é derivado segundo a equação de Nernst. É a equação que descreve as forças das reações redox e os movimentos gerais da energia livre de Gibbs em sistemas bioquímicos. Tal força (ou potencial = força) é definida como:-
onde 
é a fração de um parceiro na reação 
a 
. Portanto:
e se você agora converter para:
ou para reações redox
Agora, o potencial total em uma mistura é a soma dos potenciais individuais ou:
….etc
No nosso caso (em base em absorção ou em base clorofila) tem três componentes:
O primeiro componente mostra a força devido à concentração dos centros de reação ativos
Portanto:
é um parâmetro do 
teste e está relacionado à força gerada pela concentração de RC por antena clorofila.
O segundo componente é a força das reações da luz, que está relacionada ao rendimento quântico da fotoquímica primária:
A força motriz das reações leves é, portanto:
O terceiro componente é a força relacionada às reações sombrias (após ). Essas são reações redox normais no escuro. Expresso pelo teste como:
Onde 
= fluorescência variável relativa em 2 ms ou no passo seguinte:
Portanto, a força das reações sombrias é:
Agora, os três componentes juntos formam:
ou sem logarítmica
ou, em termos de fluorescência:
Componentes do Sistema
O M-PEA é fornecido com os seguintes componentes:
- Unidade de controle e sensor M-PEA
- HPEA/LC x 2: (20 Leafclips)
- Fonte de alimentação da rede elétrica
- Estojo de transporte
- Cabo de conexão USB para PC
- Unidade USB contendo software e manuais M-PEA+.
Comparação de Recursos da Variante M-PEA
|
Sinais Medidos |
| Variante |
Fluorescência Prompt |
Absorção P700 |
Fluorescência Retardada |
Absorção relativa |
| M-PEA-1 |
SIM
|
SIM
|
NÃO
|
NÃO
|
| M-PEA-2 |
SIM
|
SIM
|
SIM
|
SIM
|
ARTIGOS CIENTÍFICOS CORRELACIONADOS AOS EQUIPAMENTOS ACESSE:
Publicações – Hansatech Instruments Ltd
