Sistemas de fluorescência por excitação contínua como Pocket PEA, Handy PEA+ e M-PEA dependem do uso de um sistema de clipes de folhas adequado com 2 funções. Primeiramente, o clipe de folhas protege o detector de fluorescência da luz ambiente, que de outra forma “cegaria” o sensor devido aos níveis comparativamente altos de luz vermelha/infravermelha dentro da mesma faixa de onda da própria fluorescência. Em segundo lugar, o pré-condicionamento ou escuro-corte adapta uma seção da amostra antes da medição.

Qualquer medição da máxima eficiência fotoquímica do Fotosistema II () requer que a amostra seja totalmente adaptada à escuridão antes da medição. Durante a adaptação à escuridão, todos os centros de reação dentro da amostra são totalmente oxidados, tornando-os disponíveis para fotoquímica, e qualquer rendimento latente de fluorescência da clorofila é extinto. Esse processo leva um tempo variável e depende da espécie da planta, do histórico de luz anterior à transição escura e se a planta está sob estresse ou não. Normalmente, podem ser necessários de 15 a 20 minutos para se adaptar efetivamente à escuridão.

Clipes de folhas de adaptação escura são feitos de plástico, tornando-os pequenos e leves. O anel de localização (que se conecta ao sensor de fluorímetro) está posicionado sobre a área necessária da amostra e possui um orifício central de 4mm de diâmetro que é coberto por uma placa de obturador. Durante a medição, esse obturador desliza para trás para expor a amostra adaptada à escuridão aos LEDs focados e ao detector de fluorescência. Os clipes de folhas de PEA de bolso possuem um anel de localização preto, enquanto os clipes de folhas Handy PEA+ e M-PEA possuem um anel de localização branco com a parte inferior prateada, que reflete a luz incidente e minimiza o acúmulo de calor na amostra. Isso garante que a medição não seja afetada em condições de alta luz ambiente.

PEA+ Software

PEA+ é um programa multifuncional para Windows® fornecido com Pocket PEA e Handy PEA+ para configuração do sistema, aquisição de dados e análise pós-medição.

Várias técnicas diferentes de apresentação de dados foram combinadas para demonstrar efetivamente diferenças sutis na assinatura de fluorescência das amostras, o que pode indicar fatores de estresse afetando a eficiência fotossintética da planta. Os dados podem ser apresentados em gráficos gráficos, tabulados ou radiais, todos adaptados para exibir qualquer número dos 58 parâmetros medidos tanto pelo Pocket PEA quanto pelo Handy PEA+. Os dados transferidos podem ser exportados para formato CSV para análise estatística adicional em pacotes de software externos.

O PEA+ permite uma configuração aprimorada do Handy PEA+ por meio do recurso Editor de Protocolos. Os protocolos podem ser definidos para incluir ensaios de medição única ou múltipla com períodos opcionais de pré-iluminação, que podem então ser carregados para a memória do Handy PEA+ via comunicações USB. O uso de protocolos garante a máxima reprodutibilidade dos resultados durante aplicações de campo envolvendo triagem em grande escala fora do ambiente laboratorial.

O PEA+ rodará em todos os sistemas operacionais suportados pela Microsoft®.

Parâmetros comuns de fluorescência contínua de excitação medidos

 – Representa a emissão por moléculas excitadas de clorofila A na estrutura das antenas do Fotosistema II. O nível verdadeiro  só é observado quando o primeiro aceitador estável de elétrons do Fotosistema II chamado  está totalmente oxidado. Isso exige uma adaptação completa às sombras.

 – O valor máximo de fluorescência obtido para uma intensidade contínua de luz. Esse parâmetro só pode ser considerado máximo se a intensidade da luz usada for totalmente saturada e o aceitador  de elétrons estiver totalmente reduzido.

 – Indica o componente variável da gravação e relaciona-se à capacidade máxima para têmpera fotoquímica. Calculado subtraindo o  valor do  valor ().

 – Uma indicação da máxima eficiência quântica do Fotosistema II e amplamente considerada um indicador sensível do desempenho fotossintético das plantas. Apresentadas como uma proporção entre 0 e 1, amostras saudáveis normalmente atingem um valor máximo  de aproximadamente 0,85. Valores inferiores a isso serão observados se uma amostra tiver sido exposta a algum tipo de fator de estresse biótico ou abiótico que tenha reduzido a capacidade de têmpera fotoquímica dentro do PSII.  é apresentado como uma razão de fluorescência variável () sobre o valor máximo de fluorescência () e é calculado como .

 – Indica o momento em que o valor máximo de fluorescência () foi atingido. Pode ser usado para indicar o estresse amostral que faz com que o  alcance muito antes do esperado.

 – A área acima da curva de fluorescência entre  e  é proporcional ao tamanho do pool dos aceitadores  de elétrons no lado redutor do Fotosistema II. Se a transferência de elétrons dos centros de reação para o pool de quinona for bloqueada (como é o modo de ação do herbicida fotossinteticamente ativo DCMU), a área será drasticamente reduzida.

O tempo marca parâmetros

Os pacotes de software PEA Plus e M-PEA Plus extraem valores de fluorescência de clorofila a partir dos dados registrados dos fluorímetros de clorofila Handy PEA+, Pocket PEA e M-PEA em 5 Marcos de Tempo pré-definidos. Os horários são:

•  = 50 microssegundos
•  = 100 microssegundos
•  = ( passo) 300 microssegundos
•  = ( passo) 2 milissegundos
•  = ( passo) 30 milissegundos

Valores de fluorescência de clorofila nesses Marcos Temporais são usados para derivar uma série de parâmetros biofísicos adicionais, todos referidos à base temporal 0 (início da indução de fluorescência), que quantificam o comportamento do fotosistema II para (A) Os fluxos de energia específicos (por centro de reação) para:

• Absorção ()
• Armadilhas ()
• Dissipação ()
• Transporte de elétrons ()

e (B) as razões de fluxo ou resultam:

• Rendimento máximo da fotoquímica primária ()
• Eficiência () com a qual um exciton aprisionado pode mover um elétron para dentro da cadeia de transporte eletrónica mais longe do que 
• Rendimento quântico do transporte de elétrons ()

A concentração dos centros ativos de reação PSII por seção eficaz excitada () também é calculada.

Parâmetros do Índice de Desempenho (Análise OJIP)

O Índice de Desempenho () é essencialmente um indicador da vitalidade da amostra. É uma expressão geral que indica uma espécie de força interna da amostra para resistir a restrições externas. É uma Força da mesma forma que o potencial redox em uma mistura de pares redox é uma força. Exatamente, é  uma força se usada em escala logarítmica. Portanto, dizemos:

 é derivado segundo a equação de Nernst. É a equação que descreve as forças das reações redox e os movimentos gerais da energia livre de Gibbs em sistemas bioquímicos. Tal força (ou potencial = força) é definida como:-

onde  é a fração de um parceiro na reação  a . Portanto:

e se você agora converter para:

ou para reações redox

Agora, o potencial total em uma mistura é a soma dos potenciais individuais ou:

 ….etc

No nosso caso  (em base em absorção ou em base clorofila) tem três componentes:

O primeiro componente mostra a força devido à concentração dos centros de reação ativos

Portanto:

 é um parâmetro do  teste e está relacionado à força gerada pela concentração de RC por antena clorofila.

O segundo componente é a força das reações da luz, que está relacionada ao rendimento quântico da fotoquímica primária:

A força motriz das reações leves é, portanto:

O terceiro componente é a força relacionada às reações sombrias (após ). Essas são reações redox normais no escuro. Expresso pelo  teste como:

Onde  = fluorescência variável relativa em 2 ms ou no passo  seguinte:

Portanto, a força das reações sombrias é:

Agora, os três componentes juntos formam:

ou sem logarítmica

ou, em termos de fluorescência:

Todos os parâmetros medidos